W biologii molekularnej dobrym wyborem buforu i przygotowaniem do różnych etapów izolacji DNA może być różnica między przejściem do ekspresji białka lub otwarciem innego zestawu do maksi-prep, aby zacząć od nowa. Pomimo ich kluczowego znaczenia, recepty na bufory są często tylko tymi recepturami, które nie zawierają wyjaśnień ani racjonalnego uzasadnienia dla różnych składników. Jednym z takich buforów jest bufor glukozo-tris-EDTA lub GTE.
$config[code] not foundDo czego służy GTE?
GTE stosuje się do zawieszania bakterii w komórkach komórkowych przed lizą (przełamaniem) komórek i zbieraniem plazmidowego DNA w środku. Lizozym, który zmiękcza błonę komórkową, jest często dodawany wraz z buforem GTE. Uzyskanie jednorodnej zawiesiny całych komórek podczas tego etapu, tak aby następnie dodany roztwór do lizy mógł dotrzeć do wszystkich komórek, jest kluczem do uzyskania dobrych wydajności DNA. GTE został zaprojektowany do tego, zapewniając jednocześnie stabilne środowisko dla DNA.
Glukoza dla Osmolarności
50 mM (milimolarny) glukozowy cukier dodaje się do buforu GTE w celu utrzymania osmolarności, gdy stężenie substancji rozpuszczonej na zewnątrz komórek jest zbliżone do stężenia wewnątrz komórek. Zapobiega to przedwczesnej lizie komórek, co może powodować niższą wydajność DNA ze względu na agregację i degradację. Inne składniki buforu również przyczyniają się do osmolarności roztworu, ale glukoza, jako nieelektrolit, jest dobrym wyborem, ponieważ nie zakłóca właściwości buforu roztworu.
Tris stabilności pH
Tris to skrót nazwy tris (hydroksymetylo) aminometanu, który jest bardzo powszechnym buforem pH. W przypadku buforu GTE sól kwasową (Tris-HCl) dodaje się do buforu w stężeniu 25 mM. Utrzymuje to pH roztworu przy prawie fizjologicznym 8,0, idealnym pH dla zapobiegania hydrolizie kwasowej (degradacji) plazmidowego DNA i niepożądanych reakcji ubocznych innych składników komórki.
EDTA zapobiega degradacji DNA
EDTA, czyli kwas etylenodiaminotetraoctowy, wychwytuje lub "chelatuje" jony metalu z roztworu, zapobiegając ich udziałowi w niepożądanych reakcjach ubocznych. W buforze GTE EDTA dodaje się przy 10 mM. Jego głównym przeznaczeniem jest bufor do pochłaniania wolnego cynku, magnezu i wapnia, zapobiegając w ten sposób degradacji DNA przez pewne szlaki, które wymagają tych metali.
Kilka ważnych wskazówek
Chroń swój bufor GTE i przygotuj go w niewielkich ilościach, aby zapobiec rozwojowi niezamierzonych bakterii. Cukier i kontrolowane pH tworzą doskonałą pożywkę wzrostową. Zawsze używaj oczyszczonej wody. Woda z kranu może mieć nadmiar jonów metalu z rur, co może przerastać zdolność EDTA do wychwytywania. Jeśli podejrzewasz obecność interferującego RNA w próbce, dodaj RNase A w stężeniu 100 mikrogramów na mililitr do swojego bufora GTE, aby wyeliminować problem.
